PBMC分离、冻存、解冻和培养
Peripheral Blood Mononuclear Cells: Isolation, Freezing, Thawing, and Culture
外周血单个核细胞 Peripheral Blood Mononuclear Cells，包括淋巴细胞（Lymphocyte）、单核细胞（Monocyte）、树突状细胞（DC）和其他少量细胞
试剂和仪器
试剂
- 1× Phosphate Buffered Saline (PBS) Sterile PBS 无菌PBS
- Ficoll Histopaque
- 二甲亚砜（DMSO）
- 血清白蛋白（BSA）
- 10%胎牛血清（FBS）
- Freshly collected heparinised blood 新鲜采集的肝素化血液
- Ficoll Histopaque (Sigma-Aldrich, catalog number: 10771; MP Biomedicals, catalog number: 091692254)：==Ficoll==是蔗糖的多聚体，中性，平均分子量400,000，当密度为1.2g/mL，未超出正常生理性渗透压，也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。
- 细胞冻存液：FBS中加入10%DMSO
仪器
- Heparin vials (BD Biosciences, catalog number: 367886) 肝素小瓶
- Centrifuge - Sterile 15 ml centrifuge tube 无菌15ml离心管
- Pipette gun移液枪和1ml枪头
实验操作
收集4 ml人静脉血于肝素化小瓶中，轻轻翻转试管数次，使其充分混合
==PBS什么时候加==等体积稀释血液
移取4毫升Ficoll Histopaque到15ml离心管中
使用1毫升移液枪将血液缓慢地沿管壁注入Ficoll Histopaque的顶部。血液和Ficoll Histopaque应该保持为两个不同的层。
Fixed angle rotors Centrifuge 时间min，转速×g，4℃，==？升降==
立即（5min内）抽吸在组织水和培养基之间的界面中形成的白色棕褐色涂层（约1毫升）（PBMC）
用10 ml无菌PBS洗涤（在1 x g中离心时间分钟）两次。来自4ml血液的细胞的近似产率在\(10^7\)~\(10^8\)之间变化。
细胞计数或培养：加入5-10ml培养基重悬细胞，进行后续计数培养或者铺板；
细胞冻存：将细胞离心收集之后，用细胞冻存液重悬。取1-1.5ml细胞至冻存管中，放入冻存盒（冻存盒可事先在4℃冰箱预冷）。再将冻存盒放置于-80℃冰箱过夜。第二天将细胞转入液氮中长期保存。
- Ficoll Histopaque和人类血液样本、==PBS ?==之间的比例为*1:1:1。对于其它物种的PBMC的纯化比例可以是不同的。
- Ficoll Histopaque储存在4°C温度下。使用前需要在室温下保持1-2小时，因为如果PBMC在预冷的Ficoll Histopaqueon血样中分层，PBMC会受到冷休克，有时会聚集